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    如何使用鑒別性體外釋放試驗(IVRT)方法評估不同來源制劑的差異

    發布時間:2023-02-08      點擊次數:933
    體外釋放試驗(IVRT)為評價半固體制劑的藥物釋放提供了一種有效的方法,在上一期我們分享了基于FDA IVRT測試 工業指南(相關閱讀:FDA IVRT測試工業指南翻譯稿)法規要求的理解。


    為了增進對該法規指南的直觀操作體驗,銳拓儀器參考Potiwa Purazi等的《Assessment of “Sameness” and/or Differences between Marketed Creams Containing Miconazole Nitrate Using a Discriminatory in vitro Release Testing (IVRT) Method》的數據,并按照FDA的SUPAC-SS指南中的“相同性”驗收標準對兩種已上市的非專利產品進行了測試和評估,以此展示IVRT工具如何用于半固體制劑體外釋放研究及其后續的處方篩選工作,提供一個模擬真實運用場景的操作實例給廣大研究同仁參考。

     

    1.1.物料

    1.1.1.化學試劑與參考標準品

    氫化可的松(HC)標準品

    硝酸咪康唑(MCZ)標準品

    硝酸益康唑(ECZ)標準品:內標物

    已上市的氫化可的松霜Emo-Cort 1%:GlaxoSmithKline Inc,用于性能驗證測試(PVT)。

    參比制劑Daktarin®霜(2%):Janssen Pharmaceutica,用作參考產品,以開發和驗證IVRT方法。三種含有1%、2%和4%MCZ的特制霜配方也用于確認IVRT方法的靈敏性、特異性和選擇性。

    經批準且已上市的仿制配方Dermazole®霜劑(2%):Sandoz公司,與參比制劑進行比較,以證明該方法用于評估“相同性”和/或檢測差異。

    經批準且已上市的仿制配方Covarex®霜劑:與參比制劑進行比較,以證明該方法用于評估“相同性”和/或檢測差異。

    1.1.2.HPLC色譜法

    使用液相色譜法進行測試樣品的含量檢測,用于分析PVT和IVRT樣品的HPLC系統配備了Waters Alliance 2695型分離模塊,該模塊包括在線脫氣模塊、自動取樣器和光電二極管陣列(PDA)檢測器

    Waters®Empower 3軟件用于數據采集和處理。使用METTLER®AE 163型分析天平對參考標準品和霜進行稱重。P100和P1000微量移液管用于轉移和稀釋標準溶液和樣品溶液,液相色譜測試條件見下表:

    表1液相色譜測試條件

    image.png

    1.1.3.IVRT 測試系統

    使用基于Franz擴散池原理的透皮系統進行方法開發,膜暴露表面積為1.767 cm²,供體室和受體室由選定的合成膜隔開。

    1.2.方法

    1.2.1.HPLC方法驗證

    根據國際協調委員會(ICH)關于線性和范圍、精密度、重復性、準確度、特異性以及確定的定量限(LOQ)和檢測限(LOD)的指南,驗證IVRT樣品定量的HPLC方法。

    1.2.2.測試設備的機械驗證

    作為機械驗證的一部分,評估了VDC的容量和直徑、接受介質的溫度、攪拌速度、上樣的樣品體積以及VDC系統所處的環境條件。根據USP<1724>要求對VDC進行機械參數確認。

    驗證中需要計算單位面積采樣時間釋放量所需的每個VDC的孔的直徑和容量分別通過測量長度和重量確定。使用重量法評估每個VDC的容量。用游標卡尺測量孔的直徑確定膜暴露面積。

    溫度保持在32±1°C,以模擬皮膚溫度并避免擴散系數的變化。在用純化水填充VDC并平衡30分鐘后,用經過校準的數字溫度計測量六個VDC中的接收介質溫度,確認溫度達到預設要求。

    使用激光轉速表在500rpm下評估六個VDC之間的攪拌速度準確性與均勻性

    所有物理參數測量3次。根據預定義的驗收標準,計算平均值(x)和變異范圍(V),以確定六個VDC的準確性和測試池之間變異性。機械驗證的驗收標準根據USP通用<1724>。

    1.2.3.性能測試(PVT)

    使用1%氫化可的松(HC)進行PVT測試,測試條件如下:

    表2 PVT測試條件

    image.png

    1.2.4.硝酸咪康唑(MCZ)接收液研究

    評估MCZ在pH 4.5接收液(50/50 v/v)(乙醇:0.05 M磷酸鹽緩沖液)中的溶解度,一式三份。稱量藥物并放入空VDC中,加入接收液以獲得飽和濃度。將MCZ溶液在32±0.5℃下攪拌6小時。然后停止攪拌,樣品靜置過夜。提取上清液的等分試樣,過濾、稀釋并分析,以確定溶解的MCZ的濃度。理想情況下,在整個IVRT過程中,藥物在接受液中的溶解度應大于藥物最大預期濃度的10倍。

    1.2.5.膜篩選實驗

    使用各種合成膜進行膜篩選,例如Magna Nylon、Tuffryn,乙酸纖維素,纖維素酯和Strat-M。通過在32±1°C下,將每個單獨的膜浸入含有250µg/mL MCZ的10mL測試溶液中,在pH 4.5接受液(50/50 v/v)(乙醇:0.05M磷酸鹽緩沖液中,以一式兩份的方式研究MCZ在各種膜上的結合。平行評估了一組無膜對照MCZ溶液??赡艽嬖谝驗樗幬锱c膜的結合和/或其在接收液中的穩定性,為了確定MCZ含量的任何變化,使用上述HPLC方法測定所有測試溶液的濃度。此外,進行了IVRT試驗,以比較兩種膜(尼龍膜和Tuffryn膜)的釋放情況。

    1.2.6.硝酸咪康唑(MCZ)IVRT方法設計

    硝酸咪康唑(MCZ)設計的測試條件見表3:

    表3硝酸咪康唑(MCZ)IVRT方法設定

    image.png

    智能真空脫氣儀

     

    1.2.7.釋放速率計算

    使用Higuchi模型,假設存在完美漏槽條件且在偽無限劑量下,使用方程(1)確定釋放率??紤]到由于替換取樣量而導致的接收液稀釋,并使用方程(1)計算不同取樣時間下接收液中MCZ的濃度(Cn)。

    式子中,

    Qn:單位面積在時間(n)釋放的量,單位為µg/cm²

    Cn:不同取樣時間下接收液中的藥物濃度(n),單位:µg/cm3

    Vs:樣品體積(cm³)

    Vc:擴散池體積(cm²)

    Ac:膜暴露面積(cm²)

    釋放速率則為Qn與時間平方根曲線的回歸線斜率,參見USP<1724>

    1.2.8.IVRT方法驗證

    線性、精密度和重現性

    使用參考產品Daktarin®霜(2%)進行了三次IVRT試驗,在不同天測試(n=6),以確定線性、精密度和重現性。為了符合Higuchi模型的假設,單位面積的釋放量應與時間的平方根呈線性關系。

    通過使用方程(2),從獲得的18個釋放率中估算實驗內和實驗間的變異性來確定精密度和重現性

    式子中,µ=估計平均釋放速率

    σ1:實驗間標準偏差

    σ2:實驗中標準偏差

    靈敏度、特異性和選擇性

    IVRT方法的靈敏度、特異性和選擇性,在VDC(n=6)的三次IVRT試驗中進行了評估,每個VDC使用含有1%、2%和4%MCZ的霜,這些霜是特別配制和臨時制備的。通過測定釋放速率隨MCZ濃度的變化,驗證IVRT方法的靈敏度,并通過評估釋放速率與測試產品中MCZ濃度的比例來表征特異性。以釋放速率為因變量,以MCZ濃度為預測變量的線性回歸模型用于估計確定相關系數(R²)。

    為了測試IVRT方法是否有選擇性,以準確辨別產品性能差異,使用USP<1724>章節中描述的統計方法,將含有2%MCZ的霜與具有較高和較低MCZ濃度的測試產品進行比較。此外,IVRT方法準確證明“相同性”的能力,通過Daktarin®霜(2%)與自身的兩兩比較進行測試。

    耐用性

    分別在30°C和34°C下評估了該方法在標稱溫度(即32°C)下對微小波動(±2°C)的耐用性。

    劑量消耗

    為了確保IVRT實驗期間沒有過量的劑量消耗,能夠使用線性、精密度和重現性測試的結果,應計算產品的劑量消耗,確保為偽無限劑量,偽無限劑量以回收率Recovery表示,使用方程(3)計算回收率。

    回收率Recovery=最后一個時間點接受液中MCZ的累積量/產品強度×施加劑量(3)

    1.2.9.評估含有2%MCZ的霜之間的“相似性”/差異

    比較IVRT研究按照FDA的SUPAC-SS指南進行。測試產品,即兩種經批準和上市的仿制配方,Dermazole®霜(2%)和Covarex®霜(2%),與參考產品Daktarin®霜(2%)進行了比較。根據SUPAC-SS指南,將VDC隨機分配給測試(T)和參考(R)產品。將從R和T釋放的藥物的單個累積量與時間的平方根作圖。使用非參數統計方法Mann-Whitney U檢驗來計算R和T之間斜率比率的90%置信區間(CI)。由于IVRT實驗期間預計會出現一些異常值(例如,由于氣泡形成),因此使用了能消除該影響的Mann-Whitney U檢驗。

    1.2.10.IVRT方法應用

    使用兩種不同濃度(0.5%和1%)的MCZ霜,通過用含水霜稀釋Daktarin®霜(2%)來研究IVRT方法檢測制劑差異的能力。將這些稀釋產品與市售Daktarin®霜(2%)產品進行比較。

     

    2.1.HPLC方法驗證

    HPLC方法的驗證參數符合ICH指南規定的預定義驗收標準,HPLC方法驗證的結果見表4:

    表4 HPLC方法驗證結果

    image.png

    機械性能驗證

    VDC的機械性能符合USP 1724中對于機械性能的要求。

     

    2.2.性能確認測試(PVT)

    PVT實驗符合預定義的驗收標準,結果如表5所示。所得數據證實了IVRT系統的適用性和重現性。

    表5 PVT數據

    image.png

    2.3.硝酸咪康唑(MCZ)接收液研究

    在對緩沖液的不同pH和摩爾濃度進行初步實驗后,選擇了50%乙醇和50%0.05M磷酸鹽緩沖液(pH 4.5)作為IVRT的接收液,因為MCZ在該組合物中高度可溶。MCZ在接受液中的溶解度為3671µg/mL(±60.24),比方法驗證實驗期間獲得的樣品中的最高測量濃度(150µg/mL)高10倍以上,確保滿足漏槽條件。

    2.4.濾膜篩選實驗

    尼龍、醋酸纖維素和Tuffryn膜的平均回收率分別為98.40%、95.10%和98.45%,表明其與MCZ結合可忽略不計。因此,膜不太可能作為MCZ的限速屏障。相反,Strat-M和纖維素酯膜顯示出低的MCZ回收率,不符合±10%的可接受范圍。

    實驗6小時后,使用尼龍和Tuffryn膜對Daktarin霜(2%)中MCZ的體外釋放進行比較,結果顯示釋放率分別為86.64µg/cm²/min½和76.68µg/cm²/min½。綜合考慮釋放率、可用性和經濟性,選擇了成本較低的尼龍膜作為濾膜。

    2.5.IVRT方法驗證

    線性、精密度和重現性

    當R2>0.9時,確認線性。根據SUPAC-SS指南,使用線性回歸計算3次試驗(n=6)的18個釋放率。所有釋放速率均顯示單位面積釋放到接收液中的藥物量(µg/cm2)與時間平方根之間的線性關系(R2>0.99)。

    變異性參數等于σ1=36.14,σ2=27.56,µ=57.86µg/cm²/min½,導致實驗間變異性的變異系數為10.39%,實驗內變異系數為9.07%。CV<15%證實了可接受的精密度和重現性。

    靈敏度

    平均釋放率隨MCZ濃度的增加而增加:對于含有1%、2%和4%MCZ的霜,平均釋放率分別為14.56µg/cm²/min½(±4.84)、39.92µg/cm²/min½(±6.00)和73.55µg/cm2/min½(±3.78)。則認為該方法是靈敏的,因為含有1%MCZ的霜產生的平均釋放率顯著低于含有2%MCZ的霜,而含有4%MCZ的霜產生的平均釋藥率最高。

    特異性

    觀察到MCZ濃度與釋放速率之間的線性關系(R2=0.9935)(圖1)。因為測試產品的平均釋放率與MCZ濃度成比例增加,證實了IVRT方法的特異性。

    選擇性

    2%MCZ霜與1%和4%MCZ霜的配對比較,表明改方法能夠準確識別“不同”的產品,而參考產品與自身的比較則證實了“相同性”的確定(表6)。(下表改為表7)

    表6 MCZ乳膏的配對比較

    image.png

    耐用性

    使用不同溫度(即30°C和34°C)進行IVRT試驗的平均釋放率分別為55.14µg/cm²/min½(±8.15)和72.53µg/cm²/min½(±9.00)。平均釋放率與在標稱溫度(32°C)下進行的IVRT試驗(即59.30µg/cm²/min½(±7.27))得出的平均釋放率之間的偏差沒有超過15%,因此,證實了開發的IVRT方法對實驗過程中溫度微小波動的耐用性。

    劑量消耗

    為測試線性度、精密度和重現性而進行的IVRT試驗中觀察到的回收率分別為<30%,即27.11%(±2.00)、28.20%(±2.41)和29.75%(±3.26),這表明在既定的實驗條件下不可能出現任何劑量耗盡,滿足偽無限劑量要求。

    2.6.評估含有2%MCZ的霜之間的“相似性”/差異

    圖2和表7分別顯示了參考產品Daktarin霜(2%)與兩種經批準和上市的仿制制劑Dermazole®霜(2%)和Covarex®霜的釋放曲線和成對比較。

     

    表7 參考產品與仿制制劑的配對比較

    image.png

    與參考產品Daktarin霜(2%)相比,Dermazole®霜的90%置信限(2%)落在SUPAC-SS驗收標準(75–133.33%)的范圍內,確認了兩種霜之間的“相同性”,而與參考產品Daktarin軟膏(2%)以及Dermazole®霜相比,Covarex®霜完全超出了可接受范圍,表明這些霜不具有藥物等效性。

    局部劑型性能標準的差異,可以通過考慮Q1、Q2和Q3來解釋,Q1、Q2和Q3分別指定性和定量數值以及劑型微觀結構。使用Covarex®霜觀察到的藥物釋放曲線的差異可能是由于賦形劑的差異(Q1/Q2)。Covarex®霜含有咪唑烷基脲(0.2%)、尼泊金甲酯(0.15%)和尼泊金丙酯鈉(0.15%),而Daktarin®和Dermazole®霜含有苯甲酸(0.2%)。輔料的這些差異可能會改變藥物制劑的物理化學性質、皮膚滲透性、溶解度和熱力學活性以及制劑的Q3屬性。

    由于制備方法的不同,檢測配方差異的研究結果如圖3所示

    Daktarin®霜中MCZ的釋放率(2%)明顯高于1%和0.5%MCZ霜(圖3)。這可能是由于Q3的差異,即與物質的微觀結構和排列的差異,以及Q1/Q2的差異有關,圖3所示的釋放曲線表明,IVRT系統可以區分使用不同規格,不同制劑工藝的制劑。

    根據美國食品和藥物管理局阿昔洛韋軟膏和霜指南草案、SUPAC-SS非無菌半固體劑型指南和USP通用章節的建議,對已批準和上市的外用MCZ霜進行體外評價。一種仿制霜Dermazole®霜(2%)與參考產品Daktarin®霜(2%)表現出“相同”,而另一種仿制軟膏Covarex®霜(%),其MCZ釋放率不在75–133.33%的接受標準范圍內,則認為不具有體外等效性。兩種仿制霜之間的比較,表明它們在體外并不等同。

    總之,開發良好的IVRT方法,能夠準確區分不同規格產品的體外釋放率,這可以反映產品性能的相似性和/或差異。此外,結果表明,IVRT方法還具有檢測配方變化的能力,這可能是由于Q1/Q2/Q3不同所造成的。經驗證的IVRT系統提供了證據,方法能夠準確評估仿制的配方外用霜產品中MCZ的釋放。結果證實了IVRT方法適用于以可靠和可重復的方式,測量局部皮膚霜中MCZ的釋放率,并為將來使用此類產品獲得生物豁免,提供了令人信服的數據。在銳拓的下一次本固體制劑分享中,我們將接著這次的分享,展示使用IVRT來構建IVIVC,敬請各位同仁關注。

    參考原文:《Assessment of“Sameness”and/or Differences between Marketed Creams Containing Miconazole Nitrate Using a Discriminatory in vitro Release Testing(IVRT)Method》

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